Yüksek Verimli Selülaz Üreten Bir Mutant Suş Geliştirmek İçin Etil Metan Sülfonat (EMS) Yoluyla Bacillus Subtilis 171ES Mutajenezi ve Mutant Enzim Karakterizasyonu

---

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Bursa Uludağ Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, BİYOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2024

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: İREM YILDIRIM

Danışman: Elif Demirkan

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Bu çalışmada, Bacillus subtilis ES171 suşu kullanılarak yapılan EMS mutasyon çalışması sonucu olarak toplamda 538 adet mutant suş elde edilmiştir. Bu mutant suşların, uygulanan EMS dozları sonrası koloni ve selülaz hidroliz zonları ölçülerek Eİ değerleri hesaplanmış ve en yüksek Eİ değerleri sırasıyla 3.8 ile IE1, 3.7 ile IE3, 3.5 ile IE4 ve 2.7 ile IE2 mutantları ile elde edilmiştir. Selülaz zon çapları ölçüldüğünde, ana suşa (12 mm) kıyasla IE1 (19 mm), IE2 (19 mm), IE3 (17 mm) ve IE4 (14 mm) daha iyi sonuçlar vererek, ana suşun maksimum aktivite gösterdiği modifiye ortamda mutantların enzim üretim kapasitesi test edilmiştir. Mutant IE3'de ana suşa göre enzim veriminin %82 oranında arttığı, mutant IE1'de %39, mutant IE2'de %11 ve mutant IE4'de %2 oranında artış gösterdiği tespit edilmiştir. 64. Saatte optimum enzim aktivitesi gösteren IE3 mutant enzimi (857 U/mL), ana suşa kıyasla (453 U/mL) yaklaşık olarak 2 kat daha fazla enzim aktivitesi göstermiş, çalışmalara IE3 mutantı ile devam edilmiştir. Mutant suş IE3'ün enzim özelliklerini belirlemek amacı ile enzim kısmi olarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminde; amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve ultrafiltrasyon basamakları uygulanmıştır. Bu işlem basamakları sonunda enzim %3 verimle 8,1 kez saflaştırılmıştır. Kısmi saf enzimin fiziksel parametrelerde 50°Csıcaklıkta, pH 5.0 değerinde optimum değer gösterdiği tespit edilmiş ve enzimin termostabil olduğu belirlenmiştir. MnSO4, NaCl, KCl metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine aktivatör etki yaptığı saptanmış, Vmax ve Km kinetik değerleri 909 U/mL ve 0,01 mM olarak bulunmuştur. Enzimin moleküler ağırlığı 63 kDa olarak saptanıp, depolanma stabilitesinde -20 ºC'de 120 günde yalnızca %15 oranında bir aktivite kaybı gözlenmiştir.