Akademik Veri Yönetim Sistemi
YALÇIN A. (Yürütücü), Güler S., Diril K.
TÜBİTAK Projesi, 2022 - 2024
Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDA), ölümcül maligniteler arasında ilk sıralarda yer almakta olup, bu hastalığa karşı yenilikçi tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Farklı kanser türlerinde kısmen de olsa başarı gösteren hedefli moleküler terapilerin henüz PDA’da kullanımı yoktur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, PDA hücrelerinin; metabolik yeniden programlama yoluyla, proliferasyon ve sağkalım için özgün metabolik bağımlılıklar geliştirdiğini göstermektedir. PDA hücre çoğalması için gerekli metabolik enzimlerin inhibisyonu, PDA’nın tedavisi için etkili bir çözüm olabilir. Bununla birlikte, PDA hücrelerinin metabolik plastisitesi dikkate alındığında, tek bir metabolik enzim yerine birden fazla enzimin (kombine) inhibisyonunun PDA gelişimini engellemedeki başarı şansının daha yüksek olacağı değerlendirilebilir.
PDA hücrelerinin proliferasyon vb. malign özellikleri için ihtiyaç duyduğu hızlanmış glikolitik aktivitenin kontrolü, metabolik bağımlılıkları hedeflemeye yönelik kombine yaklaşımların doğal bir bileşeni olabilir. 6-fosfofrukto-2-kinaz/fruktoz-2,6-bisfosfataz ailesine ait enzimler (PFKFB1-4), tümör hücrelerinin glikolitik aktivitesinin önemli aktivatörleri arasındadır. Son zamanlarda yaptığımız bir çalışma, PFKFB2 izoenziminin PDA hücrelerinin glikolitik aktivitesi için gerekli olduğunu göstermektedir. Yaptığımız ön çalışmalar; geçici olarak PFKFB2 baskılanmasının PDA hücre proliferasyonunu inhibe ettiğini; ancak PDA hücrelerinin, kalıcı PFKFB2 işlevsizliğinin anti-proliferatif etkisinden kurtulduğunu gösterdi. Bu gözlem; PDA hücrelerinin geliştirdikleri metabolik plastisite ile PFKFB2 inhibisyonunu tolere edebildikleri görüşünü desteklemektedir. Bu görüşle; “PFKFB2 inaktivasyonu ile glikolitik aktivitesi baskılanan PDA hücrelerinin metabolik yeniden programlamaya zorlanarak proliferasyon/sağkalım için farklı metabolik gen(ler)e bağımlı hale geleceği; dolayısı ile bu gen(ler)in PFKFB2 ile birlikte genetik/farmakolojik hedeflemesinin PDA hücrelerinin çoğalmasını ve in vivo PDA gelişimini engelleyeceği” hipotezi geliştirildi. Hipotezi test etmek üzere; insan PDA hücre modelinde metabolizma-odaklı CRISPR/Cas9 taraması yapılarak PFKFB2 geni ile sentetik letal etkileşime giren metabolik gen(ler)in belirlenmesi ve bu etkileşimin PDA gelişimindeki rolünün değerlendirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak PFKFB2 geni işlevsizleştirilen PDA hücre modeli PANC-1 hücre klonları (PFKFB2 Crispr) kullanılacaktır. PFKFB2 ile sentetik letal etkileşime giren metabolik genleri bulabilmek için önceden tasarlanmış yaklaşık 3000 adet metabolik gene özgü sgRNA kodlayan lentiviral plazmitleri içeren “kütüphaneden” yararlanılacaktır. Her bir hücreye en fazla 1 (bir) sgRNA taşıyan lentiviral partikül gelecek şekilde transdüksiyon sonrası, antibiyotik seleksiyonu ile sgRNA almayan hücrelerin popülasyondan elimine edilmesi sağlanacaktır. Lentiviral partikülü genomuna entegre eden hücrelere yaklaşık 15 popülasyon katlaması yaptırılacaktır. İlk popülasyon (antibiyotik seleksiyonu hemen sonrası) ve son popülasyonlardan elde edilen genomik DNA’daki sgRNA bölgelerinin PCR ile amplifikasyonu ve Yeni Nesil Dizileme sonrası sgRNA’ların kantitasyonu yapılacaktır. Böylece seçici olarak PFKFB2 yokluğunda genomdaki temsili azalan (ya da yok olan) sgRNA’lar belirlenerek PFKFB2 ile sentetik letal etkileşime giren genler belirlenecektir. Bu aday genlerin PFKFB2 ile etkileşimi genetik/farmakolojik yöntemlerle in vitro doğrulandıktan sonra, 1 (bir) genin PDA gelişimi açısından PFKFB2 ile sentetik letal etkileşimi in vivo zenogref modelinde test edilecektir.
Proje önerisinin amacını destekler yönde elde edilecek veriler; PDA’yı durdurmaya yönelik PFKFB2 ile beraber başka bir metabolik genin kombine modifikasyonunun gündeme gelmesine ve böyle kombinasyonların geliştirilerek uygun pre-klinik modellerde ve faz çalışmalarında denenmesine bilimsel dayanak teşkil edebilir.