Aeromonas Spp. Pseudomonas Spp. Vibrio Spp. ve Mycobacterium Spp. Etkenlerinin Teşhisi Için Prototip Teşhis Kiti Geliştirilmesi

TÜBİTAK Projesi, 2024 - 2024

Proje Türü: TÜBİTAK Projesi
Başlama Tarihi: Haziran 2024
Bitiş Tarihi: Aralık 2024

Proje Özeti

qPCR analizi genellikle az miktarda DNA kalıntıları tespit edebilmesiyle ve hedef DNA üzerinde oldukça yüksek spesifik okumalara sahip olması nedeniyle rutin hastalık teşhislerinde oldukça yaygın kullanılan bir metot olmuştur (Lalucat vd., 2020). Öyleki günümüzde tüm dünyayı etkileyen koronavirüs salgınında dahi insanlardan non-invaziv yöntemlerle swap örnekleri alınmakta ve qPCR analizi ile identifikasyon yapılmaktadır. qPCR analiz yöntemi hastalık teşhisi konusunda az miktarda DNA’yı da saptayabilmesi ve diğer PCR metotlarına göre daha spesifik sonuçlar vermesi nedeniyle tüm dünyada çok yaygın kullanılan bir metot olarak geçerlilik göstermiştir.

Çalışmalarda sıklıkla kullanılan temel 16s rRNA gen bölgesi sekans analizi yakın ilişkili genusların tür ayrımlarının yapılmasında yetersiz sonuçlar verdiği bildirilmektedir (Lalucat vd., 2020). Bu yönüyle Aeromonas spp. Pseudomonas spp. Vibrio spp. ve Mycobacterium spp. türlerinin identifikasyonunda fenotipik ve/veya temel PCR-sekans analizlerinin yetersiz kaldığı ve bu analizler kullanıldığında hatalı identifikasyon sonuçları elde edildiği bildirilmektedir (Girard vd., 2020).

Kültürü yapılan balıklarda hastalık oluşturan Aeromonas hydrophila’nın qPCR TaqMan prob ile tespiti konusunda çok sayıda çalışma yapılmış ve çok düşük sayıda bakteriyel koloni varlığında dahi içme suyu, hasta balık ve çevresel izolatlarda etken teşhisinin başarılı bir şekilde yapıldığı çalışmalar bildirilmektedir (Shannon vd. 2007). Yalnızca A. hydrophila için değil ayrıca A. salmonicida, A. sobria ve A. veronii gibi diğer Aeromonas türleri için de qPCR prob çalışmaları yapılmış ve hasta balık ve su örnekleri gibi örneklerde başarılı sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Chapela vd. 2018). İçme sularından yapılan prevalans çalışmalarında Aeromonas etkenlerinin tespiti amacıyla genus spesifik primerler kullanılmış ve yapılan çalışmalarda qPCR metodunun içme sularında Aeromonas spp.’nin tespiti konusunda başarılı sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Robertson vd., 2014). Ontario gölünde göl suyundaki Aeromonas spp.’lerin teşhisinde geliştirilen qPCR primer-probların ml’de 10 bakteri hücresini tespit edebildiği ve çalışma yapılan göl sularında yüksek oranda Aeromonas türlerinin varlığı ortaya konmuştur (Khan vd., 2009).

P. aeruginosa insanlarda en bilinen patojenlerden biri olması nedeniyle P. aeruginosa’nın qPCR ile teşhisi konusunda yaygın çalışmalar bulunmaktadır. Ayrıca Pseudomonas türleri toprak, su ve diğer çevresel ortamlarda yaygın olarak bulunması nedeniyle Pseudomonas genus spesifik qPCR probları geliştirilmiş ve 0.5g toprak örneğinde %99 spesifitede teşhis yapılabildiği bildirilmiştir (Bergmark vd., 2012). Süt örnekleri ve farklı sulardan da Pseudomonas etken teşhisi konusunda surveyans çalışmaları yapılmış ve genus spesifik qPCR problarla Pseudomonas spp. teşhisinin başarılı bir şekilde yapıldığı, en düşük miktarda bile bakteriyel teşhis yapılabildiği bildirilmiştir (Khan ve Yadav 2004; Lloyd-Jones vd., 2005; Maier vd., 2021; Bahlinger vd., 2021) Sunulan proje çalışmamıza benzer olarak et ve ısı uygulaması yapılmış et örneklerinde Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Brochothrix thermosphacta ve Staphylococcus etkenlerinin qPCR spesifik primer problarla araştırılmasına yönelik çalışmalar yapılmıştır (Bahlinger vd., 2021). Yapılan çalışmada qPCR primer problarının %100 spesifite ve duyarlılıkta çalışıtığı bildirilmiş çalışma materyallerinde hedef bakteriyel etkenlerin miktarları konusunda önemli veriler elde edilmiştir (Bahlinger vd., 2021).

Vibrio türleri denizel ekosistemde ve deniz balıklarında yaygın olarak bulunan bakterilerdir. Deniz ekosisteminde Vibrio türlerinin genus bazında araştırılması konularında çalışmalar oldukça eskiye dayanmaktadır. Özellikle midyelerde Vibrio parahaemolyticus başta olmak üzere V. cholerae ve V. vulnificus’un tespiti yönünde qPCR analiz metodunun yüksek duyarlılıkta sonuç verdiği ve 0.5 gram altındaki midye örneklerinde dahi etkenlerin tespit edilebildiği bildirilmiştir (Garrido-Maestu vd., 2016). Su ürünleri ve sucul ortamlarda Vibrio sp.’nin varlığının tespit edildiği çalışmalarda geliştirilen primer probların spesifitesi ve duyarlılığı yüksek sonuçlar vererek hem patojenik hem de patojenik olmayan Vibrio türlerinin tesptinde hızlı ve başarılı sonuçlar ortaya koyduğu rapor edilmiştir (Zhang vd., 2015).

Mycobacterium enfeksiyonlarının hayvanlarda tüberküloza neden olması ve oldukça önemli zoonoz önem taşıması nedeniyle hızlı, güvenilir ve spesifik etken teşhisinin önemli olduğu vurgulanmaktadır. Bu yönüyle Paris’in Seine nehrindeki yüzey sularından yapılan örneklemelerde Mycobacterium spp.’nin varlığı konusunda qPCR primer prob tasarımı yapılmış ve alınan su örneklerinde spesifite ve duyarlılık çalışmalarına tabi tutulmuştur. Araştırmacıların sonuçlarına göre Mycobacterium spp. teşhisinde genus-spesifik qPCR metodunun araştırmada kullanılan diğer metotlara göre %9-56 oranında daha yüksek başarılı sonuç verdiği bildirilmiştir (Radomski vd., 2010). İnsanlarda hastalık oluşturan Mycobacterium spp.’lerin teşhisinde de qPCR genus-spesifik primer problar kullanılmış ve hem miks kültürlerde hem de az sayıdaki doku/swap örneklerinde etken teşhisinin başarılı bir şekilde yapıldığı belirlenmiştir (Tobler vd., 2006; Lim vd., 2008).

Sunulan projemize benzer olarak, insan ve hayvan hastalıklarının tespitinde, göl suyu, içme suyu ve atık suyu gibi örneklerde spesifik bakteri türlerinin yerine genus spesifik araştırmaların yapıldığı çalışmalar yaygındır. qPCR araştırmalarına alternatif olarak mikrobiyom çalışmaları da günümüzde ön plandadır. Ancak Mikrobiyom çalışmaları konusunda yeni teknolojik araştırmalar yapılıyor olmasına rağmen, mikrobiyom çalışmalarının 16S rRNA gen bölgesine dayalı yapılması ve pahalı bir yöntem olması nedeniyle hastalık tespit çalışmalarından ziyade mikrobiyal çeşitlilik çalışmalarında kullanılmaktadır. Dolayısıyla hastalık teşhisi veya hastalık survey çalışmaları amacıyla qPCR analiz metodu yaygın ve doğruluğu yüksek bir metot olarak kullanılmaktadır. qPCR çalışmalarının diğer yöntemlere göre hızlı, ekonomik, spesifik ve duyarlı sonuçlar vermesi nedeniyle ayrıca paraziter kaynaklı hastalıkların teşhisinde ve hayvanlarda immun genlerin araştırılmasıyla immun kaynaklı hastalıkların teşhisinde de yaygın olarak kullanılmaktadır (Stensvold vd., 2012). Bu yönüyle viral, paraziter ve bakteriyel hayvan hastalıklarının teşhisinde qPCR metodunun kullanılabilirliği ön plana çıkmaktayken akvaryum balık hastalıklarının teşhisinde genus spesifik ya da tür spesifik primerlerin kullanımı henüz yeterli düzeyde olmamıştır. Akvaryum balıklarında hastalık yapan bakteriyel etkenlerin tür teşhisleri konusunda çalışmaların yetersiz olması, qPCR ile tür spesifik hastalık etkeni çalışmalarını da sınırlamaktadır. Bu yönüyle öncelikle genus spesifik çalışmaların yapılması ardından tür spesifik çalışmalarla da tespit edilen bakterilerin tür dağılımlarının belirlenmesi olumlu olacaktır.