NTCP Transfekte Edilmiş Karaciğer Kanser Hücre Hattında HBV-Enfeksiyonu için in vitro Hücre Kültürü Modeli Oluşturulması ve non-coding RNA'ların Bu Modelde Analiz Edilmesi, 324S308 numaralı

Hepatit B (HBV), küresel sağlık problemlerinden biri olan Hepatosellüler karsinom’un (HCC) en yaygın etiyolojik sebebidir. Tanının gecikmesi ve tedavi seçeneklerinin sınırlı olması nedeniyle HCC’nin mortalitesi yüksektir. Dolayısıyla kronik hepatit B’nin ve bu süreçte dokuda meydana gelen moleküler değişikliklerin anlaşılması HBV-ilişkili HCC’nin önlenmesi ve tedavisi için önemlidir.  Günümüzde, özellikle siroz zemininde gelişen, lokal veya uzak metastazı olmayan HCC hastalarının tedavisinde ortotopik karaciğer nakli (orthotopic liver transplantation: OLT) uygulanmaktadır. Ancak nakil sonrası nüks, bu zor ve maliyetli tedavinin başarısını azaltan ve prognozu kötüleştiren önemli bir faktördür. HBV enfeksiyonunun HCC hücrelerindeki agresifliği veya yayılımı arttırdığı dolayısıyla prognozu da olumsuz etkilediği düşünülmektedir.

Kurumumuz, Ülkemizde karaciğer nakli yapılan başlıca merkezlerden biridir ve bu alanda çeşitli çalışmalar gerçekleştirilmektedir. 2018 yılı itibariyle ekibimizin çalışmaları, HBV-ilişkili siroz zemininde HCC gelişen hastalarda OLT sonrası nüks gelişiminde rol oynayabilecek moleküler mekanizmaları araştırmaya odaklanmıştır. Bu amaçla bu vakalarda mikroRNA'lar (miRNA), uzun kodlamayan RNA'lar (LncRNA) dahil olmak üzere kodlamayan RNA'lar (ncRNA) ve karsinogenez ile ilgili sinyal yolakları incelenmiştir. İlk olarak, HBV ilişkili olan ve nakil sonrası beş yıllık takip süresince nüks gelişen beş hasta ile nüks gelişmeyen 43 hastanın karşılaştırıldığı çalışmamızda, nüks olan hastalarda miR-21’in aşırı ekspresyonunun prognoztik bir gösterge olduğu belirlenmiştir. Daha sonra, 2019 yılında vaka sayısı ile incelenen parametreler arttırılarak yeni bir proje yazılmış ve araştırma “2019 Gilead ile Hayat Bulan Fikirler” kapsamında desteklenmiştir. Bu proje kapsamında HBV ve HCV ilişkili siroz zeminde gelişen HCC vakaları çalışmaya dahil edilmiş, nakil sonrası nüks gelişen 20, nüks gelişmeyen 112 vaka olmak üzere toplam vaka sayısı 132’ye çıkartılmıştır. Bu ikinci projemizde, OLT sonrasında nüks gelişen HCC hastalarının primer tümörleri ile takiplerinde nüks gözlenmeyen hastaların primer tümörleri arasındaki farklılıkların ortaya çıkartılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda tümör dokusunun invazyon, migrasyon ve epidermal mezenkimal geçiş (EMT) süreçlerinde rol oynayan sinyal yolaklarında görev alan ncRNA’ların ekspresyon profilleri analiz edilmiştir. Kırk sekiz vaka ile başladığımız ilk çalışmamızda 22 farklı miRNA arasından, nüks gelişimi ile ilişkili bulunan miR-21, bu 132 vakalık seride de araştırılmış ve yeni hasta grubunda da nüks gelişen tümörlerde nüks gelişmeyen tümörlere göre daha yüksek düzeyde eksprese olduğu görülmüştür. Ayrıca LncRNA’lardan MALAT1’in ekspresyonu nüks eden vakalarda daha yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte MALAT1 ekspresyonunun, HCV nedenli HCC’lerle karşılaştırıldığında HBV nedenli HCC’lerde daha yüksek olması dikkat çekicidir. Ek olarak MALAT1’in mTOR ile de pozitif korelasyon gösterdiği belirlenmiştir. Çalışmamızda, PVT1 ve SNGH16 nakil sonrası nüks gelişimi ile ilişkilendirilen diğer LncRNA’lardır. PVT1, EMT belirteçlerinden TWIST ekspresyonu ile korelasyon, SNGH16 ise MEK yolağında yer alan ERK1 ile pozitif korelasyon göstermiştir. Elde edilen veriler “Development of Novel Scoring System for The Prediction of Hepatocellular Carcinomas Recurrence Following Liver Transplantation” başlığı ile International Congress of ILTS, ELITA, and LICAGE’de sunulmuştur.

Hasta-tabanlı çalışmalarımızda elde ettiğimiz verilerin literatüre sunulmadan önce hasta özelliklerini taklit eden in-vitro modellerde analiz edilerek desteklenmesi gerekmektedir. Bu model, çalışmamızın bulguları güncelliğini ve özgünlüğünü korurken literatürde paylaşılmasına katkı sağlayacaktır. Ayrıca araştırma, HBV’nin hücre içi replikasyon dögüsünün dinamiklerinin, antijenik proteinlerinin ekpresyonunun ve onkojenik mekanizmalara etkisinin incelenmesi için kullanılacak olup gelecekteki çalışmalarımıza da temel oluşturacaktır. Bu kapsamda planlanan projede, HBV ilişkili HCC tümör özeliklerini yansıtan standart bir in-vitro modelin oluşturulması ve hasta-tabanlı çalışmalarımızda anlamlı bulunan biyobelirteç adaylarının (miR-21, PVT1, MALAT1 ve SNGH16) bu modelde analiz edilmesi amaçlanmaktadır. 

Proje kapsamında öngörülen faaliyetler başarıyla yürütülmüş ve öngörülen etkilerin oluşturulmasına önemli ölçüde katkı sağlanmıştır. Çalışmalar sonucunda elimizde NTCP plazmitleri ve HBV enfeksiyonunu modelleyebileceğimiz hücre kültürü sistemi bulunmaktadır. Bu durum, HBV enfekte HCC’de ncRNA’ların ekspresyonu, işlevleri ve düzenlenmesi ile ilişkilerinin daha kapsamlı araştırılmasına imkan tanımaktadır.

Proje ile ayrıca, miR-21 ve SNHG16 genlerinde anlamlı farklılık bulunmamasına rağmen, MALAT1, HULC ve PVT1 genlerinin ekspresyon düzeylerinin belirgin şekilde arttığı gösterilmiştir. Bu bulgu, HBV’nin özellikle bazı lncRNA’lar üzerinden hepatokarsinogenez sürecini tetikleyebileceğini ortaya koymuştur.

Scratch testi ve klonojenik analiz sonuçları, HBV enfeksiyonunun hücre göçü ve proliferasyonu artırdığını ortaya koymuş, bu da HBV’nin tümör progresyonunu hızlandırabileceğine işaret etmiştir. Bu deneysel bulguların klinik anlamı özellikle organ nakli sonrası nüks riskinin açıklanması açısından önemlidir.

Bulgular, organ nakli sonrası nüks riski yüksek hastaların önceden belirlenmesine, böylece donör organların daha verimli kullanılmasına ve tedavi başarısının artırılmasına doğrudan katkı sağlamaktadır.

Proje çıktılarının yüksek atıf potansiyeli taşıyacağı Q1 nitelikli dergilerde yayınlanabileceği ve öngörülmektedir. Ayrıca elde edilen veriler, 19-23 Kasım 2025 tarihleri arasında gerçekleştirilecek 8.Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi’nde paylaşılacaktır. Bunların yanında, qPCR tabanlı tanı kitleri ve ncRNA inhibitörleri gibi non-invaziv biyobelirteç temelli ürünlerin geliştirilmesine zemin hazırlanmıştır. ncRNA’ların potansiyel ilaç hedefi olarak değerlendirilmesi ile yeni tedavi stratejilerinin oluşturulmasına katkı sağlanmıştır.